Waters专家对HPLC液相色谱的十步优化建议

2011-06-19

　固然作为一种简单的技术，HPLC仍然存在着可能出错的地方，比如说压力混乱、管道阻塞、和层析柱不能永远使用等题目。以下来自著名科学仪器设备制造公司Waters  Corp和LCResources的专家提出的几点HPLC优化建议。
　　
　　1.了解你要用的缓冲液
　　
　　“人们总是为了对相同的处方做出了不同的解释而给我支付昂贵的咨询费。”
　　
　　--LCResources总裁TomJupille
　　
　　HPLC依靠于分析物之间的微分均衡，固定相(填料),和活动相(溶剂)。常规的活动相一般由50%的乙腈加上50%，10mM，pH2.5的磷酸钾缓冲液组成，至少有四种混合它们的方法：正确法、轻易法、错误法和笨方法。
　　
　　正确的方法应该是：按照正确的比例混合10mM的磷酸和10mM的磷酸二氢钾达到pH2.5。然后混与等体积的乙腈混合。这个过程需要天生标准的操纵流程，明确标定缓冲液的配方和有效期等。
　　
　　2.天天更换缓冲液
　　
　　水活动相有可能被细菌，模具和样品残留污染，这些污染的出现可能会升高系统的压力和进步检测仪的检测背景，当然当装活动相的瓶子底部出现混浊的时候可以很明显的发现这些污染，但是当这些污染以薄膜的形式存在于瓶底或者瓶壁则不轻易发现。因此要不天天更换操纵的缓冲液，要不确保层析方法中包含10%-15%的有机溶剂，减少污染。
　　
　　3.防止分歧格样品进进层析柱
　　
　　“尽最大可能使分歧格的样品阔别层析柱”
　　
　　--FredHutchinsonCancerResearchCenter的蛋白质组主管Jupille.PhilipGafken
　　
　　要分离的样品一定不能对层析柱产生伤害，研究职员在进行分离之前需要考虑像：盐是否会沉淀?往垢剂是否会包被或者损害填料等等这样的题目，而且专家也建议将单纯的蛋白沉淀步骤(从血浆中分离分析物的通用方法)转换为固相或者液相提取。比如说，假如你想寻求有机药物代谢物，你可以将样品与有机溶剂混匀使所想要的化合物进进溶剂中，而将大量的杂质留在水相中。
　　
　　4.使用保护柱
　　
　　保护柱或者预柱是指置于主分析柱前的一根短(0.5-2cm)，相对便宜的柱子。花大概80到400元购置这样一根保护柱可以明显地延长昂贵的分析柱的寿命。有研究职员在正常的环境下进行了对比实验，结果发现一根柱子可以进行1，000-2，000次填注，而安置了保护柱之后，柱子可以进行10，000次的填注之后仍未出现稍微的改变。而且保护柱的填料也应该周期性的改变，大约每200-500次填注后更换一次--假如样品较脏则应该更频繁更换。
　　
　　5，不要让填料保存在水缓冲液中
　　
　　在包含活动相的缓冲液还残留在系统中的时候切勿封闭HPLC系统。这是由于溶剂可以蒸发，留下缓冲液结晶，终极导致内部损伤填料，由此引起一些小毛病。专家们以为用不含溶剂的缓冲液冲洗HPLC系统或者从不封闭HPLC系统，这样在其它条件一致的情况下可以延长柱子寿命，另外把柱子放进运载溶剂(shippingsolvent)中保存(例如纯乙腈)也可以延长层析柱寿命--由于运载溶剂对柱料的损伤最小。

　6.确定“四周环境”是指什么
　　
　　很多HPLC方法要求适合的环境温度(ambienttemperature)，但总会碰到这样的题目：这

里的室温指的是仲春的蒙特利尔还是七月的波多黎各呢?也就是说，实际上HPLC的工作温度可以是为所欲为的-4°C到25°C之间的任意温度。到底什么是合适的周遭环境，我们必须根据具体的情况来确定，这是由于色谱法依靠于分析物在固定相和活动相之间的平衡进行分离，而平衡当然依靠于温度，所以当你改变温度，平衡分布也会改变，保存时间改变，可能出现误识别样品峰。
　　
　　7.天天检查系统的压力
　　
　　固然正确值依靠于你所使用的方法，但条件是系统的压力不能明显的高于或者低于前一天的压力，或者说不能不稳定，比如2，000±10psi可能很不错，而1,500±700psi则不适合。研究职员需要经常记录压力，当然很多现代的HPLC系统具有记录泵压力数据的特性，这些数据在维修中起到不可估量的作用。比如说假如说有一天你忽然在一系列的运转中得到很多阴性结果。有可能是所想要的样品峰偏离了它所对应的保存时间区(retentiontime)，这个时候你要做的首要事情就是检查泵压力的记录
　　
　　8.不要在检查接头方面省事
　　
　　不要忽略泄漏。随着时间的积累这对于实验的影响更大，不仅仅是不方便的题目，渗漏使得保存时间的偏移，导致所想要的样品峰延迟出现。专家的建议是：至少会将能见到的接头都扫视一遍。假如你发现了渗漏现象，切断接头并替换。
　　
　　9.一次只能更换一样东西
　　
　　当东西出现题目的时候，切忌一次性换完所有东西。在维修中，应该从系统整体出发，因此不能一次更换预柱，溶剂，和检测灯，而应该每次只更换一样东西。
　　
　　10.天天检测
　　
　　在你不知道HPLC的日常运转情况下，你不可能对它进行维修，所以专家建议天天对HPLC进行检测，收集相关的数据。